... снова будет запущен метод Application_Start для следующего запроса (-ов) или нет?
Это зависит от версии ASP.NET, версии сервера хостинга и/или другого контекста?
Я пытаюсь определить, хорошо ли загружать критические сборки там или нет. Например, сборки доступа к данным, которые жизненно важны для функционирования всего приложения или нет. Неспособность загрузить такую сборку сделает последующие запросы бесполезными.